Módosított mátrixok fejlesztése és alkalmazása kapilláris elektrokromatográf-tömegspektrométer analitikai rendszerben

A munka első részében egy új típusú kapilláris elektrokromatográf/tömegspektrométer (CEC/MS) ún. segédfolyadék nélküli (sheathless) interfészt építettünk meg. Az eszköz a tömegspektrométerek nanoelektroszpré (nanoESI) ionforrásaihoz széleskörően használt kihúzott végű aranyozott boroszilikát kapilláris és CE rendszerhez használt kvarc kapilláris kombinálásán alapszik, így a sérülékeny hegy bármikor cserélhető anélkül, hogy a munkaigényesen elkészíthető CEC oszlopot elveszítenénk. Az intefész érzékenysége megfelel a nanoESI érzékenységének és rendkívül kis térfogatú mintából (néhány nanoliter) is képes analízist végezni. A rendszert sikerrel alkalmaztuk olyan sok arginint tartalmazó peptidek gyors (2-3 perc analízisidő kb. ötöde HPLC-s mérésnek) mérésére ahol a közvetlen tömegspektrometriás mérést a trifluoracetát ionnal (TFA) történő erős ionpárképző hatás akadályozza.Peptidek tandem tömegspektrometriás (MS/MS) szekvenálásának egyszerűbbé tételére származékképzésen alapuló CEC/MS/MS módszert dolgoztunk ki. Az állandó pozitív töltést és brómot tartalmazó szubsztituensek bevitelével sikerült növelni a detektálás érzékenységét valamint a Br izotópeloszlása miatt könnyebben értelmezhetővé váltak az MS/MS fragmensek, mindezt a kapilláris-HPLC-hez képest rövidebb analízisidővel. A módszer segítségével elkülöníthetőek a lizin és az arginin végű, valamint felismerhetőek a ciszteint és a tirozint tartalmazó peptidek, ezzel segítve a adatbázison alapuló fehérjeazonosítást. | A simple design of a sheathless CEC/MS interface was constructed and used for the separation of peptides by combining the widely used nanospray gold-coated borosilicate tips and the separation capillary. The nanospray needle fabricated in our laboratory can be used for several runs. A fast capillary electrochromatographic method was also developed for MS analysis of peptides containing numerous basic amino acids. This interface permits analysis of extreme low sample quantities (a few nanoliters) as well.Tandem mass spectra (MS/MS) is commonly used to determine the sequence of peptides. Charged derivatives was developed to simplify and to direct the fragmentation to form only N or only C-terminus ions to facilitate interpretation of their mass spectra. In our work a simple and fast CE/MS/MS method is presented for the study of the labeling reaction with 2,5-dibromo-N-ethyl-thiazolium and 2,5-dibromo-N-ethyl-pyridinium salt. Introduction of a bromine atom further improves the interpretation of the MS/MS spectra by doubling the peaks which reduces the complexity of the spectra hence it helps to interpret them. The method also permits of distinguishing the Arg, Lys, Tyr and Cys containing residues

Synthesis of the extracellular domain of GLP-1R by chemical and biotechnological approaches

The extracellular domain of the glucagon-like peptide-1 receptor, GLP-1R, is responsible for the binding of GLP-1, and a handful of additional agonists (such as exenatide, lixisenatide, and liraglutide) used daily for treating type II diabetes mellitus. Lead discovery and optimization, however, require binding studies, which, in turn, necessitate the total synthesis of GLP-1R, comprising 108 residues. A protein domain of 10–15 kDa size could be obtained either by expression in E. coli or by ligating solid-phase peptide synthesis (SPPS)-made fragments. However, direct overexpression fails to give a properly folded protein, as GLP-1R forms an inclusion body, which fails to refold due to improper disulfide pairing. Several bacterial strains, constructs, and fusion partners were probed and it was found that only co-expression with MBP gave a 3D-fold allowing the native disulfide bond pattern formation. Some fusion partners can act as covalently linked or in situ chaperones for guiding the refolding of GLP-1R toward success. Therefore, the bottleneck to preparing GPCR extracellular domains is the correct pairing of the Cys residues. As a proof-of-concept model, nGLP1-R was made by SPPS to form the purified full-length polypeptide chain, subjected to self-guided or spontaneous Cys pairing. However, the formation of correct SS-pairs was lagging behind any protocol in use support, and the bottleneck of large-scale protein production relies on the risky step of proper refolding, which is sometimes possible only if a suitable fusion partner effectively helps and catalysis of the correct disulfide formation

Módosított peptidek - peptidek térszerkezetének valamint biológiai hatásának modulálási lehetőségei = Modified peptides - Possibilities for modification of the 3D structure and the biological action.

cisz-(1R,2S) és transz-(1S,2S)-ACHC (2-amino ciklohexán karbonsav) homooligomereket szintetizáltunk és vizsgálatokat kezdtünk kedvezményezett térszerkezetükkel kapcsolatban. Heterokirális homooligomereket szintetizáltunk 2R,3S valamint 2S,3R amino norbornén és norbornán karbonsav felhasználásával, mad meghatároztuk térszerkezetüket. Heterokirális homooligomereket szintetizáltunk alternáló gerinckonformációjú cisz és transz ACPC (2-amino ciklopentán karbonsav) felhasználásával. Megállapítottuk, hogy a kiralitással egyértelműen szabályozható a kapott oligomerek másodlagos szekezete Számos transzporterpeptidet illetve ezek fluoreszcensen jelzett származékait állítottuk elő és vizsgáltunk meg abból a célból, hogy melyik az optimális lipo-foszfopeptidek sejtbejuttatására. A korábbi vizsgálatok szerint funkcionálisan aktívnak bizonyult Gab1 foszfopeptid fragmens aktív centrumának meghatározása céljából számos új foszfopeptidet szintetizáltunk és vizsgáltunk meg. Enzimrezisztens peptidtiofoszfát analógokat állítottunk elő. Szintetizáltunk egy minifehérjét és néhány származékát. Megvizsgáltuk a módosítások konformációs hatásait Hidrazinoprolin (2-aza ACPC) felhasználásával homo és heterooligomereket készítettünk és térszerkezetvizsgálatokat végeztünk. Hidrazinoprolin és cisz valamint transz ACPC felhasználásával elkészítettük a lehetséges alternáló heterooligomereket. Ezekkel NMR és VCD vizsgálatokat valamint molekuladinamikai számításokat végeztünk Módszereket dolgoztunk ki N-glikopeptidek szintézisére. | Cis-(1R,2S)- and trans-(1S,2S)-ACHC (2-aminocyclohexane carboxylic acid) homooligomers were synthesized and the examination of their steric structure was started. Heterochiral homooligomers were synthesized using (2R,3S)- and (2S,3R)-aminonorbornene and norbornane carboxylic acid, and their steric structure was determined. Using cis- and trans-ACPC (2-aminocyclopentane carboxylic acid) having alternating backbone conformation, heterochiral homooligomers were synthesized. The secondary structure of the oligomers could be unequivocally regulated with the chirality of the monomers. Numerous transporter peptides and their fluorescently labeled derivatives were synthesized and tested in order to find the optimal cell-permeable fragment for the internalization of lipo-phosphopeptides into the cell. To determine the active site of a Gab1 phosphopeptide fragment whose activity was proved before, several new phosphopeptides were synthesized and examined. Moreover, enzyme resistant peptide thiophosphate analogues were prepared. A miniprotein and some analogues of it were synthesized and the effect of the modification on the conformation was examined. Using hydrazinoproline (2-aza-ACPC), homo- and heterooligomers were prepared and used for structural investigations. The possible alternating heterooligomers were synthesized with the use of hydrazinoproline and cis- and trans-ACPC. These compounds were subjected to NMR and VCD investigations, and molecular dynamics calculations. Different methods have been worked out for the synthesis of N-glycopeptides

Gliko és foszfopeptidek szintézisének lehetőségei = Synthesis of glyco and phosphopeptides

Módszereket dolgoztunk ki oligo-szachariddal glikozilált N-glikopeptidek szintéziséremind konvergens, mind építőkő módszerrel. Védőcsoportkombinációkat optimalizáltunk O-glikopeptidek szintézisére, valamint optimalizáltuk a kapcsolási reakciót a glikán és a védett aminosav között. Számos foszfopeptidet és sejtpenetráló peptidet szintetizáltunk, részben fluoreszcensen jelzett formában is. Új foldamer molekulát (N-amino prolin) állítottunk elő és építettünk be béta-aminosav oligomerekbe. Megvizsgáltuk a kapott oligomerek térszerkezeti és stabilitásviszonyait. | We improved the applicable methods for the synthesis of N-glycopeptides including convergent and building block approach. The protecting group combinations for the synthesis of O-glycopeptides was optimized and we improved the coupling conditions for the reaction of the glycosyl donor and acceptor. Numerous phospho and cell-penetrating peptide were synthesized and a part of them was fluorescently labelled. A new foldamer molecule (N-amino proline) was prepared and incorporated into beta-amino acid oligomers. The conformation and the stability of the new oligomers was investigated